试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人α1抗胰蛋白酶（α1-AT）水平。用纯化的人α1-AT 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入α1抗胰蛋白酶（α1-AT），再与HRP标记的α1-AT 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的α1 抗胰蛋白酶（α1-AT）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人α1 抗胰蛋白酶（α1-AT）浓度。

人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)ELISA试剂盒操作步骤：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

1600ng/ml  5 号标准品  150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液

800ng/ml  4 号标准品  150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液

400ng/ml  3 号标准品  150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液

200ng/ml  2 号标准品  150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液

100ng/ml  1 号标准品  150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl，然后再加待测样品10µl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.  温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4.  配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用

5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此

重复 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。

7.  温育：操作同 3。

8.  洗涤：操作同 5。

9.  显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15 分钟.

10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

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