一、实验目的

1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。

2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。

二、实验原理

    ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反 应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗 涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中。酶促反应只进行一次，而 抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗（抗抗体）、三抗再次进行免疫反应。

   目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电 
比色测定抗体含量。

三、操作步骤

①抗原包被：兔抗人IgG 作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。

②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。

③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h.

④洗涤：用洗涤液洗3次。

⑤加待测样品（一抗）：将含单克降抗体的细胞培养上清在另-块板上用PBS 连续稀释（按照1：2或1：10），100μL /孔加到 已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS 或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育 1~2h。

⑥洗涤：用洗涤液洗3次。

⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l ：8000稀释，100μL／孔，加盖37℃恒温箱温育1h。

⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。

⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm 处各孔的吸光值，阳性反应的稀释度为待测 
样品的效价。

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